Microscopía de fluorescencia de alta resolución 17.10.2014

Para ver la celda y su contenido, debemos tomar un microscopio. Su principio de funcionamiento es relativamente sencillo: los rayos de luz atraviesan un objeto y luego entran en lentes de aumento, de modo que podemos ver tanto la célula como algunos de los orgánulos que hay en su interior, como el núcleo o las mitocondrias.

Pero si queremos ver una proteína o una molécula de ADN, o mirar un gran complejo supramolecular como un ribosoma o una partícula de virus, entonces un microscopio óptico ordinario será inútil. Allá por 1873, el físico alemán Ernst Abbe dedujo una fórmula que pone un límite a las capacidades de cualquier microscopio óptico: resulta que es imposible ver un objeto más pequeño que la mitad de la longitud de onda de la luz visible, es decir, menos de 0,2 micrómetros.

La solución, obviamente, es elegir algo que pueda reemplazar la luz visible. Puede usar un haz de electrones y luego obtenemos un microscopio electrónico: puede observar virus y moléculas de proteínas en él, pero los objetos observados durante la microscopía electrónica caen en condiciones completamente antinaturales. Por lo tanto, la idea de Stefan W. Hell del Instituto de Química Biofísica de la Sociedad Max Planck (Alemania) resultó ser un gran éxito.

La esencia de la idea era que un objeto podría irradiarse con un rayo láser, lo que pondría a las moléculas biológicas en un estado excitado. A partir de este estado, comenzarán a pasar al estado normal, liberándose del exceso de energía en forma de radiación de luz, es decir, comenzará la fluorescencia y las moléculas se harán visibles. Pero las ondas emitidas serán de longitudes muy diferentes, y tendremos ante nuestros ojos un punto indefinido. Para evitar que esto suceda, junto con el láser de excitación, el objeto se trata con un haz de extinción, que suprime todas las ondas excepto las que tienen una longitud nanométrica. La radiación con una longitud de onda del orden de los nanómetros sólo permite distinguir una molécula de otra.

El método se denominó STED (disminución de emisiones estimuladas), y fue por esto que Stefan Hell recibió su parte del Premio Nobel. Con la microscopía STED, el objeto no está completamente cubierto por la excitación del láser a la vez, sino que, por así decirlo, es atraído por dos delgados haces de rayos (excitador y extintor), porque cuanto menor es el área que emite fluorescencia en un momento dado, mayor es la intensidad de la luz. la resolución de la imagen.

Posteriormente, el método STED se complementó con la llamada microscopía de molécula única, desarrollada de forma independiente a fines del siglo XX por otros dos laureados actuales, Eric Betzig del Instituto Howard Hughes y William E. Moerner de Stanford. En la mayoría de los métodos fisicoquímicos que se basan en la fluorescencia, observamos la radiación total de muchas moléculas a la vez. William Merner acaba de proponer un método mediante el cual se puede observar la radiación de una sola molécula. Mientras experimentaba con la proteína fluorescente verde (GFP), notó que el brillo de sus moléculas se puede encender y apagar arbitrariamente manipulando la longitud de onda de excitación. Al encender y apagar la fluorescencia de diferentes moléculas de GFP, se pudieron observar en un microscopio óptico, ignorando la limitación nanométrica de Abbe. La imagen completa podría obtenerse simplemente combinando varias imágenes con diferentes moléculas luminosas en el campo de visión. Estos datos se complementaron con las ideas de Eric Betzig, quien propuso aumentar la resolución de la microscopía de fluorescencia mediante el uso de proteínas con diferentes propiedades ópticas (es decir, en términos generales, multicolores).

La combinación del método de extinción de excitación de Hell con el método de imposición de suma de Betzig-Merner ha hecho posible desarrollar microscopía de resolución nanométrica. Con su ayuda, podemos observar no solo los orgánulos y sus fragmentos, sino también las interacciones de las moléculas entre sí (si las moléculas están marcadas con proteínas fluorescentes), lo que, repetimos, no siempre es posible con los métodos de microscopía electrónica. El valor del método difícilmente puede sobreestimarse, porque los contactos intermoleculares son sobre los que se apoya la biología molecular y sin los cuales es imposible, por ejemplo, ni la creación de nuevos fármacos, ni la decodificación de mecanismos genéticos, ni muchas otras cosas que yacen en el campo de la ciencia y la tecnología modernas.